属于碱基类似物，结构与dTMP相似，只是在第五个碳原子上由溴取代T的甲基。5-BU能产生两种互变异构体，一种是酮式，一种是烯醇式。酮式可与A互补配对，烯醇式可与G互补配对，这样当5-BU掺入DNA复制时就会导致碱基转换突变。因此，5-溴尿嘧啶可以使AT转换为GC，引起基因突变。
溴尿嘧啶5位的氢为溴所代换的人工碱基相似体。在生物体内有与胸腺嘧啶相似的活动作用，一般作为一种追踪物质而被利用．可被DNA包围．但由于这里所聚合的核酸密度大，所以用超离心沉淀已成为可能。另外由于这种核酸光感性变大，因此可应用于细胞选择性破坏和人工突变的诱发。

5-溴尿嘧啶在生物医学和制药领域具有广泛的用途。它常被用作染料、试剂和药物的原料。它也被用于合成核苷类药物、化学保护基和芳香化合物的合成。